杂交瘤技术探讨篇-分泌目标抗体的杂交瘤细胞株

发布日期:2020-01-31

  杂交瘤技术自1975年由科学家George Köhler and Cesar Milstein 发明以来,逐渐被相关领域的科学家们所普及。随着近些年免疫治疗的火热,抗体作为免疫治疗的重要组成部分,使得作为主要抗体发现途径之一的杂交瘤技术,不断被优化,加速抗体发现的过程,推动新药研发。

  杂交瘤技术简要过程如下:小鼠骨髓瘤细胞与小鼠的脾脏细胞(主要是B淋巴细胞)融合,将融合后的细胞铺板。加入HAT选择性培养基筛选,骨髓瘤细胞无法存活,而脾脏细胞在体外条件下也只能存活7-10天。最终使得只有融合了淋巴细胞的骨髓瘤细胞存活,也即杂交瘤细胞。此时,当克隆长到一定大小后,即上清中富集的抗体满足筛选的过程时,即进行杂交瘤的筛选工作。通常是使用ELISA的方式,筛选具有结合特异性抗原的杂交瘤细胞株。看脸的时代它能否独占鳌头路虎揽胜极光九龙高,但大多数情况下,所得到的细胞株均为混合的细胞株,我们需要进一步得到单克隆的细胞株。此过程即为本篇文章所探讨的问题,分泌目标抗体的杂交瘤细胞株的挑选,即单克隆细胞株的挑选。

  常用的方法即为有限稀释法(limited dilution),挑选单克隆细胞株,除此之外仍有许多的其他方法被开发以及不同的程度的使用,本文将介绍5种挑选单克隆细胞株的方式,同时分析不同方式的利弊。

  有限稀释法是杂交瘤技术过程中筛选得到混合细胞株后分离单克隆的标准方法。在筛选到具有阳性细胞株的孔后,将该孔内的细胞重悬,稀释,并将其再次铺板到若干块96孔板中,平均每孔1个细胞。根据具体情况,细胞数量可调整。细胞培养7-10天后,显微镜下计数每孔内细胞克隆数量。将单克隆细胞孔内的上清,再次进行ELISA筛选,挑选阳性单克隆细胞株。为确保挑选到单克隆细胞株,会再次重复1-2次有限稀释的过程,挑选稳定的单克隆细胞株。

  由此可见,有限稀释法是耗时并且工作量大的过程。并且,在亚克隆的过程中,有可能将阳性细胞株丢失。但有限稀释法,仍是目前较为主流的方法,其操作简单易行,无需其他仪器设备辅助等。

  另外一种筛选,确证,建立单克隆细胞株的方式就是直接将不分泌抗体的杂交瘤细胞株杀死。LEAP技术就是去除不分泌抗体的杂交瘤细胞株,使得分泌抗体的细胞株增殖。对于这种方法,杂交瘤细胞生长于捕获基质处理过的细胞培养板。分泌的抗体在抗体分泌细胞的附近被捕获,然后通过荧光标记的抗原定量。LEAP仪器可以将培养板的细胞成像,并通过相应的软件确定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。其他所有的细胞将通过一系列的定向激光脉冲消除。

  ClonePix FL 仪器是由美谷公司研发的自动化成像,8860444.com,识别,挑选分泌抗体的杂交瘤细胞的仪器。杂交瘤细胞融合后,铺板到半固体培养基中,直到克隆长大。为挑选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,培养基中通常含有荧光标记的捕获抗体或抗原。分泌的抗体在该细胞株的周围被荧光标记的分子所捕获。ClonePix FL 可以根据克隆大小,形状,以及荧光强度等,挑选目的克隆。在确定目的克隆后,该仪器可以将这些克隆分别地转移到96孔培养板中。ClonePix 2高通量细胞克隆筛选系统全自动的筛选流程可以在更短时间内筛选更多克隆。

  (4)客观的成像分析,使用户可以准确筛选到更优表达水平的克隆,并尽可能早的排除表达水平低的干扰克隆

  (5)根据克隆表达水平自动排序,并准确、自动化挑取克隆,避免有限稀释的繁琐和出错几率。

  第二种原位筛选识别分泌抗体的杂交瘤细胞的方式是基于修饰的细胞表面标记物。这些标记物使得分泌的抗体以非共价结合的方式固定在分泌抗体的杂交瘤细胞的周围。将这些细胞与荧光标记的抗原共孵育,然后通过流式分选,挑选出特异性的杂交瘤细胞。但是如何使得杂交瘤细胞带有修饰的细胞表面标记物呢?这些杂交瘤一般是通过将带有修饰标记物的骨髓瘤细胞与小鼠的脾脏细胞融合。该种方法最复杂的部分就是产生具有细胞表面修饰物的骨髓瘤细胞系。此前有文献报道,黄大仙论坛。在骨髓瘤细胞表面表达可以结合抗体的蛋白,如protein A,protein G,protein L等,或者利用亲和素和生物素的相互作用构建细胞表面修饰物。

  在分子生物学中,对毒素类物质的抵抗常常用于筛选目的阳性克隆。同样的原理运用于挑选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞中。对于这种方法,首先将目的抗原与毒素小分子共价连接,然后在完成HAT的选择过程后,直接加入到培养基中。抗原-毒素聚合物会导致那些不分泌抗体的杂交瘤细胞,以及分泌的抗体是非特异性抗体的杂交瘤细胞死亡。当分泌抗原特异性的抗体时,结合抗原-毒素聚合物是不会对细胞产生毒性的。应用这种方法即可以快速,简便,高效的鉴定,分离目标单克隆细胞株。


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